LysoSensor Yellow/Blue DND-160 (PDMPO)（Solid）

黄/蓝色溶酶体荧光探针（固体）

主要应用：酸性细胞器（比如：溶酶体）的pH荧光探针

产品信息

产品描述

为满足研究者研究活细胞内溶酶体生成和功能的动力学特征，特此开发Lysosensor探针，一种区分酸性细胞器的荧光pH指示剂。该系列染料属于向酸性探针，由于质子化聚集在酸性细胞器上。这一质子化也使得因弱碱性侧链而封闭荧光的探针得以荧光释放，促使荧光信号增强。因此，LysoSensor探针遇酸后荧光信号呈现pH依赖性的增强。

LysoSensor Yellow/Blue DND-160（黄/蓝色溶酶体探针）是一种独特的比率型探针，呈现pH依赖性的双激发和双发射光谱峰（见Fig 1）。然而，活细胞中这一探针仅呈现pH依赖的双发射光谱（发射波长比率~450/510nm，激发波长~365nm）。在酸性细胞器中，LysoSensor Yellow/Blue DND-160主要呈现黄色荧光，而在酸性偏低的细胞器中具有蓝色荧光。双发射波长的测定允许比率成像分析在酸性细胞器比如：溶酶体或精子顶体内的pH。其pKa值约为4.2。

LysoSensor Yellow/Blue DND-160，常常简写成PDMPO，普遍用作海洋硅藻中二氧化硅沉积和运输的一种示踪剂。

Fig 1. LysoSensor Yellow/Blue DND-160的pH依赖性光谱反应图（A）荧光激发光谱（B）荧光发射光谱。

LysoSensor Yellow/Blue DND-160（黄/蓝色溶酶体探针）的作用机制：

PDMPO本身是一种弱碱，中性状态下能自由穿透进入细胞膜。一旦进入酸性细胞器，分子变得质子化且困住不能外露，进而堆积。这一质子化反应激发荧光的变化。PDMPO的pKa约4.2~4.47，使其对典型溶酶体的pH范围（pH 4.5~5.0）高度敏感，因此，是一种优秀的溶酶体pH探针。

产品特征

1） 外观：固体

2） 分子式：C₂₀H₂₂N₄O₃

3） 分子量：366.41

4） 溶解性：溶于DMSO

5） 亚细胞定位：溶酶体

6） pKa：约4.2~4.47

7） 最大激发：~329nm（中性），~384nm（酸性）

8） 最大发射：~440nm（蓝光，中性），~540nm（黄光，酸性）

9） 检测仪器：荧光显微镜、共聚焦显微镜等

10）化学结构式：

保存与运输方法

保存：-20ºC避光干燥保存，至少一年有效。 

运输：冰袋运输。

注意事项

1） 整个染色过程中需注意避光。

2） 为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。

使用方法

一、 储存液的制备

使用前，先将本品取出回温至室温，并对其进行简单低速离心使固体降至管底。于超净台内开盖，直接往1mg PDMPO（Mw：366.41）加入2.729ml高质量无水DMSO（新鲜开封未受潮），用枪吹打，使其完全溶解后得到1mM的储存液。按单次用量将储存液分装，≤-20°C避光干燥保存，尽量避免反复冻融。亦可根据实际需求配制成其他浓度的储存液，前提是保证固体完全溶解。

二、 工作液的制备

最佳工作浓度需根据不同的实验要求、细胞类型、细胞或组织的膜通透性等进行优化。
利用生长培养基或合适的缓冲液将1mM储存液稀释至工作浓度，工作液需现配现用。对于Lysosensor系列溶酶体探针，推荐工作液浓度≥1µM；
【注意】：

1）为了降低探针加载过度可能引起的假阳性，建议在不影响染色效果的情况下尽量使用低浓度。

2）若细胞在染色后于不含染料的培养基中孵育，会观察到荧光信号的衰减和细胞的空泡化现象。

三、染色步骤（贴壁细胞）
1）将细胞置于培养皿中的盖玻片上，加入合适培养基，使其爬片生长。
2）待细胞生长到合适密度，吸除培养液，加入适量37℃预热的含探针培养基（必须完全覆盖住细胞），在适合特定细胞类型的生长条件下孵育细胞30min-2h（具体孵育时间需根据细胞类型而定）。

3）利用不含探针的新鲜培养基替换上述染色液，并且用装有合适滤片的荧光显微镜进行观察。若染色不够充分，建议增加染料浓度或延长染色时间，使得染料能聚集在溶酶体上。

【注意】：

对LysoSensor Yellow/Blue DND-160的内化（Internalization）进行动力学研究发现，活细胞摄取此探针的速率在几秒之内即可完成。然而严重不足的是，该探针展示出溶酶体“碱化效应”，从而，长时间孵育会导致溶酶体pH上升。因此，仅仅当此探针于37℃孵育细胞1-5min，才是有用的pH指示剂。

四、染色步骤（悬浮细胞）
1）离心沉淀细胞，吸除上清。
2）利用适量 37℃预热的含探针培养基重悬细胞，在适合特定细胞类型的生长条件下孵育细胞30min-2h（具体孵育时间需根据细胞类型而定）。
3）离心，吸除染色液，加入新鲜培养基重悬细胞。
4）用装有合适滤片的荧光显微镜进行观察。若染色不够充分，建议增加染料浓度或延长染色时间，使得染料能聚集在溶酶体上。
【注意】：

另一种方法，悬浮细胞可能会粘附到经BD Cell-Tak处理的盖玻片上，此时，可用类似于贴壁细胞的方法进行染色。

附录I 溶酶体探针总表

溶酶体系列探针常见问题

1. 如何选择合适的溶酶体探针？

答：对于溶酶体定位实验，请选择Lysotracker系列探针，根据自身的实验体系，结合lysotracker系列探针的荧光特征，选择合适激发和发射波长的荧光探针。Lysotracker Blue DND-22（MX4320-50UL）探针的光量子产率偏低，建议在非荧光选择受限的情况下，推荐选择其他几款Lysotracker探针。对于酸性细胞器（比如溶酶体）的pH测定实验，请选择Lysosensor系列探针。

2. 溶酶体探针染色后是否能做固定？

3. 溶酶体探针是否能用于流式分析和荧光光度计分析？

4. 溶酶体探针LysoTracker Green DND-26（MX4318-50UL） 和LysoSensor Yellow/Blue DND-160

（MX4316-50UL）的建议孵育时间多少？